Немецкие, чешские и швейцарские исследователи воспользовались химической модификацией, флуоресцентной визуализацией, масс-спектрометрией сверхвысокого разрешения и математическим моделированием, чтобы количественно оценить внутриклеточный транспорт липидов у млекопитающих и составить его атлас. Основным механизмом распределения специфических липидов по мембранам органелл оказался быстрый транспорт без участия внутриклеточных везикул. Отчет о работе опубликован в журнале Nature.
Эукариотические клетки производят тысячи видов липидов, относящихся к десяткам классов. Они выполняют структурные и сигнальные функции, а также служат запасом энергии. Липиды распределены в мембранах клетки и ее органелл неравномерно, соответствуя их идентичности и функциям. Биосинтез липидов происходит преимущественно в эндоплазматическом ретикулуме, и далее они переносятся везикулами и участками контакта мембран органелл антероградно в направлении плазматической мембраны, претерпевая по пути химические модификации. Затем эти соединения утилизируются посредством ретроградного транспорта в ретикулум или катаболизма в лизосомах, пероксисомах и митохондриях. Вопрос о том, как качественно и количественно происходит транспорт отдельных видов липидов (особенно ретроградный), отвечающий за состав специфических мембран, оставался малоизученным. Одной из основных причин этого служила сложность их визуализации.
Андре Надлер (André Nadler) из Института молекулярной клеточной биологии и генетики Общества Макса Планка вместе с коллегами создал библиотеку бифункциональных (фотоактивируемых и вступающих в клик-реакции) липидов, внося в их алкильные цепи две минимальных модификации (диазириновую и алкиновую). Подобные изменения позволяют проводить мониторинг одновременно локализации и метаболизма молекул с помощью сочетания флуоресценции с вытеснением метки и масс-спектрометрии ультравысокого разрешения, данные которых используют для математического моделирования. В библиотеку вошли четыре класса липидов: фосфатидилхолины и фосфатидилэтаноламины (основные фосфолипиды), фосфатидовые кислоты (ключевые промежуточные вещества липидного метаболизма) и сфингомиелины (основные сфинголипиды). Этими молекулами частично заменили липиды в клетках человеческой остеосаркомы линии U2OS и следили за их транспортом в мембраны органелл и метаболизмом.
Между кинетикой транспорта как отдельных липидов, так и их классов обнаружились четкие различия. Фосфатидилэтаноламины, фосфатидовые кислоты и полиненасыщенные фосфатидилхолины быстро оказывались в эндоплазматическом ретикулуме, в то время как насыщенные фосфатидилхолины и сфингомиелины дольше задерживались в плазматической мембране, после чего стойко локализовывались в эндосомах. Моделирование определило, что прямой ретроградный транспорт в эндоплазматический ретикулум без участия везикул происходит в 11 раз быстрее, чем везикулярный, для всех липидов. Наиболее быстрым он был у фосфатидилэтаноламинов, за которыми следовали полиненасыщенные фосфатидилхолины и сфингомиелины, у насыщенных фосфатидилхолинов он был относительно медленным.
Дополнительные опыты показали, что невезикулярный путь служит основным видом ретроградного транспорта всех классов липидов, особенно структурных, за исключением сфингомиелинов и более селективен, чем везикулярный. При этом в селективности этого транспорта принимают участие АТФ-зависимые мембранные переносчики липидов флиппазы, которые значительно ускоряют перемещение фосфатидилэтаноламинов, в меньшей степени влияя на другие классы.
Дополнительные эксперименты и моделирование продемонстрировали, что фосфатидилэтаноламины и фосфатидовые кислоты метаболизируются быстрее, чем фосфатидилхолины с таким же составом жирных кислот, полиненасыщенные фосфатидилхолины обмениваются быстрее мононенасыщенных и насыщенных, а сфингомиелины относительно стабильны. В целом транспорт липидов оказался значительно быстрее их метаболизма, и именно селективный невезикулярный транспорт, а не метаболическая конверсия, играет основную роль в дифференциальном распределении разных видов липидов в органеллах. При этом метаболизм принимает участие в накоплении пространственно локализованных внутриклеточных пулов нейтральных липидов, поскольку кинетика синтеза эфиров холестерина, но не триацилглицеридов зависит от положения остатков жирных кислот в исходном фосфатидилхолине, и эти резервные липиды распределяются в клетке по-разному.
Таким образом, минимально модифицированные биспецифичные липидные пробы, флуоресцентная визуализация, масс-спектрометрия высокого разрешения и математическое моделирование представляют собой действенный метод количественного картирования транспорта отдельных видов липидов. Авторы работы использовали полученные данные, чтобы составить атлас внутриклеточного транспорта липидов, и выложили его в открытый доступ, как и оригинальный датасет.
Ранее биофизикам удалось визуализировать другой вид внутриклеточного транспорта — перемещение белка кинезина, который служит для переноски других молекул, по микротрубочкам цитоскелета.
